从细胞或组织裂解物中富集目标蛋白及其互作复合物，并通过 Western Blot、质谱或其他正交方法验证候选蛋白互作。
实验目的
从细胞或组织裂解物中富集目标蛋白及其互作复合物，并通过 Western Blot、质谱或其他正交方法验证候选蛋白互作。
适用范围与实验要求
- 样本：新鲜或低温保存的培养细胞
- 样本：组织匀浆与原代细胞
- 样本：表达标签蛋白的工程化细胞
- 样本：经优化的亚细胞组分
- 物种：人、小鼠、大鼠、其他需核对抗体反应性的物种
- 难度与耗时：中高级，约 1–2 天
- 安全：样本按来源执行生物安全要求；全程低温并使用蛋白酶、磷酸酶抑制体系；避免交叉污染和重复冻融。
实验原理
使用特异性抗体与 Protein A/G 磁珠或琼脂糖介质捕获天然蛋白复合物，经温和洗涤去除非特异结合后洗脱，并比较输入、流穿、免疫沉淀和阴性对照中的目标信号。
标准工作流程
- 低温制备澄清的非变性蛋白裂解物
- 保留输入并测定蛋白浓度
- 预清除高背景样本
- 抗体与样本预孵育或先偶联磁珠
- 捕获免疫复合物并温和洗涤
- 选择变性或温和方式洗脱
- 通过 Western Blot 检测诱饵和候选互作蛋白
- 使用反向 Co-IP、突变体或质谱进行正交验证
设备、试剂与耗材
- 设备：冷冻离心机、旋转混合器、磁力架或低速离心设备、电泳转膜与成像系统
- 试剂：温和非变性裂解液、经 IP 验证的一抗、Protein A/G 磁珠或树脂、洗涤和洗脱缓冲液、蛋白酶与磷酸酶抑制剂
- 耗材：低吸附离心管、滤芯枪头、电泳与转膜耗材、抗体孵育盒
必需对照与 QC
- 输入样本 Input
- 同型 IgG 对照
- 磁珠空白
- 已知互作阳性对照
- 反向 Co-IP 或标签对照
- 输入中可检测诱饵和候选蛋白；IgG 与磁珠空白背景低；目标蛋白在特异 IP 中显著富集；候选互作具有重复性并获得反向或正交证据。
关键参数与结果解释
裂解液强度、盐浓度、抗体质量、样本输入、抗体与磁珠比例、孵育时间、洗涤强度及洗脱方式共同决定复合物保持与背景水平。
共同沉淀提示蛋白处于同一复合物，但不能单独证明直接结合。应结合定位、突变、竞争、体外结合或质谱结果判断互作的特异性和生物学意义。
常见问题与排错
富集低时检查抗体 IP 验证、表位可及性和裂解条件；背景高时增加预清除和洗涤并降低输入；互作丢失时降低去污剂和盐强度并缩短操作；重链干扰时使用交联抗体、标签体系或轻链特异二抗。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。