对 DNA 或 RNA 靶标进行无需标准曲线的绝对定量，并用于拷贝数、低丰度变异、残留核酸、载体滴度或稀有事件检测的方法开发和质量控制。
实验目的
对 DNA 或 RNA 靶标进行无需标准曲线的绝对定量，并用于拷贝数、低丰度变异、残留核酸、载体滴度或稀有事件检测的方法开发和质量控制。
适用范围与实验要求
- 样本：基因组 DNA 与质粒 DNA
- 样本：经逆转录的 RNA/cDNA
- 样本：血浆、血清或其他体液核酸
- 样本：细胞、组织、载体和工艺样本核酸
- 物种：不限，取决于引物、探针和参考序列
- 难度与耗时：中高级，约 1–2 天
- 安全：样本按来源管理；扩增前后严格分区；使用滤芯枪头和阴性对照控制气溶胶与扩增产物污染；临床用途需独立法规验证。
实验原理
将反应体系分配为大量独立微反应单元，终点扩增后按阳性与阴性分区计数，并基于泊松统计估算原始样本中的靶分子浓度。
标准工作流程
- 定义靶标、预期浓度范围和判读规则
- 提取并评估核酸质量和抑制物
- 设计并预验证引物探针特异性
- 按动态范围调整样本稀释或预处理
- 配制反应并完成稳定分区
- 执行终点扩增并读取所有有效分区
- 设置阈值、检查雨滴或边界分区并进行泊松校正
- 报告浓度、置信区间、拷贝数或变异等位基因频率并完成复核
设备、试剂与耗材
- 设备：数字 PCR 分区或液滴生成系统、终点扩增设备、分区读取与分析系统、核酸定量和常规 PCR 辅助设备
- 试剂：数字 PCR 预混液、目标特异引物与探针、逆转录体系（RNA 项目）、限制性消化或样本预处理试剂（按需）、参考物质与阴阳性对照
- 耗材：平台专用芯片、卡匣或液滴耗材、PCR 管板与封板膜、低吸附无核酸酶管、滤芯枪头
必需对照与 QC
- 无模板对照
- 提取阴性对照
- 阳性参考物质
- 野生型或阴性基质
- 独立稀释与重复对照
- 阴性对照无超阈值阳性；阳性参考结果在接受范围；有效分区数和分区体积满足平台要求；重复间一致；目标占比位于可可靠泊松校正的动态范围。
关键参数与结果解释
核酸完整性、靶标可及性、分区数、阳性比例、引物探针效率、阈值设置、抑制物、稀释倍数和有效分区率决定定量精度。
数字 PCR 给出特定反应条件下的绝对浓度估计，但仍受采样误差、提取回收、逆转录效率和靶序列变异影响。低丰度结果需采用足够输入、重复和独立方法确认。
常见问题与排错
有效分区少时检查耗材、加样和分区系统；雨滴多时优化退火条件和引物探针；阴性背景高时排查污染和非特异扩增；阳性饱和时增加稀释；重复差异大时提高混匀、分区数和样本均一性。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。