定量评估启动子、增强子、转录因子、信号通路或 miRNA 对报告基因表达的调控，并使用内参报告校正转染与细胞数量差异。
实验目的
定量评估启动子、增强子、转录因子、信号通路或 miRNA 对报告基因表达的调控，并使用内参报告校正转染与细胞数量差异。
适用范围与实验要求
- 样本：贴壁或悬浮细胞系
- 样本：原代细胞（需递送优化）
- 样本：稳定报告细胞系
- 样本：含候选调控序列的质粒构建
- 物种：不限，取决于细胞模型和调控元件
- 难度与耗时：中等，约 2–4 天
- 安全：遵循细胞培养和重组 DNA 管理要求；使用病毒递送时执行相应生物安全审批。
实验原理
将实验报告载体与内参载体共同递送至细胞，处理后依次检测两种发光酶活性，以实验报告信号与内参信号比值表示相对调控活性。
标准工作流程
- 确认报告构建序列和阅读框
- 优化细胞密度与转染条件
- 设置实验、内参及阴阳性对照
- 共同转染或递送报告载体
- 按设计给予化合物、配体或基因干预
- 在预设时间裂解细胞
- 按固定时序读取两种发光信号
- 计算报告/内参比值并完成重复与统计分析
设备、试剂与耗材
- 设备：细胞培养系统、微孔板发光检测仪、多道移液器或自动化平台、细胞计数设备
- 试剂：实验与内参报告载体、转染或基因递送试剂、双报告裂解与底物体系、阳性通路激动剂或抑制剂
- 耗材：白色不透光微孔板、细胞培养板、无菌滤芯枪头、低吸附离心管
必需对照与 QC
- 空载体对照
- 基础启动子对照
- 阳性调控对照
- 未转染对照
- 内参报告与细胞活率对照
- 未转染背景低；阳性对照产生预期变化；内参信号处于线性范围且组间稳定；技术重复变异满足标准；处理不造成不可接受的细胞死亡。
关键参数与结果解释
细胞密度、载体比例、总 DNA 量、转染毒性、处理时间、底物平衡、读板延迟和信号线性范围决定可比性。
报告/内参比值用于校正递送和细胞数量，但内参本身可能受处理影响。显著变化应结合载体突变、内源基因表达、蛋白信号或染色质证据确认。
常见问题与排错
信号弱时优化转染、载体量和检测时间；内参波动时降低内参载体并验证处理影响；孔间差大时统一细胞密度和加样时序；高毒性时降低总核酸或更换递送体系。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。