从样本固定、通透和封闭，到抗体荧光染色、显微成像与定量分析的完整科研工作流，适用于单标、多标和共定位实验。
实验目的
在细胞或组织中定位目标蛋白，比较其表达、亚细胞分布以及与其他标志物的共定位关系。
适用范围与实验要求
- 样本：培养细胞、冰冻或石蜡组织切片、类器官及三维培养样本
- 物种：人、小鼠、大鼠；其他物种需确认抗体反应性
- 耗时：通常 1–2 天；全程需避免强光并保持各组采集条件一致
- 安全：固定剂、通透剂和荧光染料按化学品安全规范使用
标准工作流程
- 依据靶标和样本选择固定方式
- 对胞内靶标进行适度通透
- 封闭非特异结合位点
- 孵育已验证的一抗
- 充分洗涤并避光孵育荧光二抗
- 核复染、抗淬灭封片
- 使用统一曝光、增益或激光参数采集图像
- 盲法或自动化定量信号强度、阳性比例及共定位
设备、试剂与耗材
- 设备：荧光或共聚焦显微镜、湿盒、摇床、图像分析工作站
- 试剂：固定液、通透液、封闭液、IF 验证一抗、荧光二抗、核染料和抗淬灭封片剂
- 耗材：载玻片、盖玻片、细胞爬片或成像板、避光孵育盒和低吸附枪头
必需对照与 QC
- 阳性对照、已知阴性样本、无一抗或仅二抗对照、同型对照和单染对照
- 阳性对照定位符合预期，阴性和仅二抗对照背景低
- 各通道无明显串色，图像无饱和，同批样本使用一致采集参数
- 定量应包含足够视野、独立生物学重复和可追溯的图像处理步骤
常见问题
信号弱时优化固定、通透、抗体浓度和曝光；背景高时加强封闭与洗涤；串色时调整荧光组合并使用顺序扫描；淬灭快时减少光照并更换抗淬灭封片剂。
产品选型入口
科研用途说明：本流程用于科研实验设计与产品选型，不作为临床诊断结论。