从粪便、环境、组织或低生物量样本完成微生物 DNA 提取、16S 区域扩增、文库构建、测序与群落组成分析。
实验目的
从粪便、环境、组织或低生物量样本完成微生物 DNA 提取、16S 区域扩增、文库构建、测序与群落组成分析。
适用范围与实验要求
- 样本：粪便与肠道内容物
- 样本：口腔、皮肤与呼吸道拭子
- 样本：土壤、水体和食品环境样本
- 样本：组织、体液等低生物量样本
- 物种：细菌和古菌群落；真菌需采用 ITS 等独立方案
- 难度与耗时：高级，约 3–7 天；测序与生信分析另计
- 安全：未知环境和人体来源样本按风险评估处理；扩增前后严格分区；避免气溶胶与批次交叉污染。
实验原理
通过适配样本基质的裂解与纯化获得微生物 DNA，使用带接头与索引的引物扩增 16S rRNA 基因特定可变区，测序后进行去噪、特征表构建、分类注释和多样性分析。
标准工作流程
- 标准化采样、运输和低温保存
- 机械与化学联合裂解微生物
- 纯化 DNA 并评估抑制物
- 使用目标可变区引物完成有限循环扩增
- 检查扩增产物并完成磁珠纯化
- 加入唯一索引并进行文库 QC
- 等摩尔混样、测序和样本表核对
- 去噪、污染过滤、分类注释和多样性分析
设备、试剂与耗材
- 设备：样本均质或珠磨设备、PCR 仪、磁力架与核酸定量设备、片段分析和测序平台
- 试剂：微生物 DNA 提取体系、高保真 PCR 预混液、16S 区域引物与索引、磁珠纯化试剂、文库定量标准
- 耗材：无 DNA 污染采样耗材、PCR 管板与封板膜、滤芯枪头、低吸附保存管
必需对照与 QC
- 采样空白
- 提取空白
- PCR 无模板对照
- 已知组成 mock community
- 批次间桥接样本
- 提取与 PCR 空白无超阈值污染；mock community 组成在预设偏差内；文库浓度和片段分布合格；样本 reads 达到分析需求；低生物量样本通过污染评估。
关键参数与结果解释
采样方式、保存时间、裂解强度、提取批次、引物区域、PCR 循环数、阴性对照阈值、测序深度和分析数据库会系统性影响结果。
相对丰度不等于绝对菌量，16S 通常不能稳定解析到菌株水平。组间差异应结合批次、混杂因素、测序深度和多重检验解释，并在关键结论上采用 qPCR、培养或宏基因组验证。
常见问题与排错
DNA 得率低时加强机械裂解；抑制明显时稀释或二次纯化；空白污染时排查试剂批次与操作环境；扩增偏倚大时降低循环数并核对引物覆盖；低 reads 时重新定量与混样。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。