将 DNA 或 RNA 样本转化为具备正确片段分布、接头、索引和定量结果的可测序文库。
实验目的
将 DNA 或 RNA 样本转化为具备正确片段分布、接头、索引和定量结果的可测序文库。
适用范围与实验要求
- 样本：基因组 DNA
- 样本：cfDNA
- 样本：总 RNA 或 mRNA
- 样本：扩增子和富集产物
- 难度与耗时：高级，约 1–3 天
- 安全：临床来源或环境样本按批准的生物安全流程处理；扩增前后区域严格分离以控制污染。
标准工作流程
- 确认样本质量与投入量
- 按应用完成片段化或目标富集
- 进行末端修复、加尾和接头连接
- 磁珠纯化或大小选择
- 有限循环扩增并避免过度扩增
- 测定文库浓度和片段分布
- 核对索引兼容性并等摩尔混合
- 完成上机前变性稀释和批次记录
设备、试剂与耗材
- 设备：PCR 仪、磁力架和自动化移液平台（按需）、荧光定量仪、片段分析或电泳设备
- 试剂：片段化和末端修复试剂、接头与索引、高保真扩增预混液、磁珠纯化与大小选择试剂、文库定量标准品
- 耗材：低吸附 PCR 管板、滤芯枪头、封板膜、无核酸酶离心管
必需对照与 QC
- 阴性文库对照
- 阳性参考样本
- 唯一双索引策略
- 批次内定量和片段标准
- 阴性文库无明显产物；文库浓度达到平台要求；片段主峰与分布符合设计；无明显接头二聚体；索引不冲突且样本表可追溯。
关键参数与结果解释
输入量、片段化强度、接头比例、磁珠比例、PCR 循环数、索引唯一性、文库定量方法和混样策略是核心变量。
上机前 QC 不能替代测序后质量评估；需结合 reads 数、Q30、比对率、重复率、插入片段和覆盖均一性判断文库性能。
常见问题
得率低时核对输入和连接效率；接头二聚体高时调整接头或磁珠比例；文库过度扩增时减少 PCR 循环；混样不均时使用适当定量方法并重新计算摩尔浓度。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。