从目标序列扩增、载体准备、连接或组装、转化、筛选到测序确认，获得可追溯的重组克隆。
实验目的
从目标序列扩增、载体准备、连接或组装、转化、筛选到测序确认，获得可追溯的重组克隆。
适用范围与实验要求
- 样本：基因组 DNA
- 样本：cDNA
- 样本：合成 DNA
- 样本：现有质粒或 PCR 产物
- 难度与耗时：中等，约 2–5 天
- 安全：遵循重组 DNA 和宿主微生物管理要求；含抗生素培养物及染料按实验室规范处置。
标准工作流程
- 设计引物、阅读框和组装边界
- 高保真扩增并确认单一目标条带
- 纯化插入片段并准备载体
- 完成连接或同源组装
- 转化并设置适当对照
- 筛选菌落和小量培养
- 质粒提取、酶切或菌落 PCR 初筛
- 双向测序确认完整构建
设备、试剂与耗材
- 设备：PCR 仪、凝胶电泳与成像系统、恒温孵育与摇床、微量离心机
- 试剂：高保真 DNA 聚合酶、引物和模板、限制性内切酶或组装酶、感受态细胞与培养基、质粒提取试剂
- 耗材：PCR 管板、电泳耗材、培养皿和培养管、无核酸酶枪头
必需对照与 QC
- 无模板对照
- 阳性扩增对照
- 载体自连对照
- 未转化对照
- 测序双向覆盖
- 阴性对照无扩增或菌落；目标条带大小正确；克隆筛选命中率达到预期；最终序列覆盖整个插入和连接区，阅读框与突变状态正确。
关键参数与结果解释
引物退火、模板质量、聚合酶保真度、插入载体摩尔比、末端设计、转化效率和宿主稳定性决定成功率。
克隆成立需同时满足结构和序列证据。仅凭菌落 PCR 或单次酶切不能排除点突变、方向错误和重排。
常见问题
无扩增时优化模板和退火；非特异时提高退火温度或重设计引物；背景菌落多时检查载体去磷酸化和纯化；重排时更换稳定宿主并降低培养温度。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。