从宿主与载体选择、小试筛选和培养放大，到亲和捕获、层析抛光、换液浓缩及质量控制的一站式蛋白制备方案。
实验目的
获得满足生化、结构、细胞或免疫学研究要求的重组蛋白，并建立可重复、可放大的表达纯化工艺。
适用范围与实验要求
- 宿主：大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞
- 要求：明确结构域、标签、翻译后修饰、产量、纯度、单体比例、活性、内毒素和无菌要求
- 耗时：从 3 天到数周，取决于构建和工艺复杂度
- 安全：重组 DNA、宿主细胞和工艺化学品按机构规范操作
标准工作流程
- 评估序列、结构域、信号肽、标签、宿主和载体
- 构建并通过测序验证表达克隆
- 小试筛选温度、时间和诱导或转染条件
- 放大培养并收获细胞或培养上清
- 低温裂解或澄清上清并控制蛋白降解
- 使用亲和层析完成捕获
- 按纯度和单体要求增加离子交换或分子筛抛光
- 换液、浓缩、无菌过滤和分装
- 完成纯度、身份、聚集、内毒素、残留和活性 QC
设备、试剂与耗材
- 设备：摇床或细胞培养系统、冷冻离心、破碎设备、层析系统、超滤、电泳和定量设备
- 试剂：载体和宿主、培养基和诱导剂、裂解与抑制剂、亲和树脂、离子交换或分子筛填料及储存缓冲液
- 耗材：培养容器、过滤器、层析柱、超滤管和低吸附储存管
必需对照与 QC
- 空载体或未诱导对照、可溶与不溶组分、输入/流穿/洗涤/洗脱组分
- SDS-PAGE 或 SEC 纯度、浓度与回收率、身份确认和单体比例
- 依据用途评估内毒素、宿主残留、无菌或生物负载以及功能活性
常见问题
表达低时优化载体、宿主和诱导；包涵体多时降温或更换宿主；树脂结合差时检查标签暴露、pH 和离子强度；聚集时优化缓冲液并减少浓缩和冻融应力。
产品选型入口
科研用途说明：具体工艺参数应依据目标蛋白和最终用途进行验证。