从细胞、组织、体液或纯化样本完成蛋白提取、还原烷基化、酶切、肽段净化、定量策略选择、LC-MS/MS 采集和数据质量评估。
实验目的
从细胞、组织、体液或纯化样本完成蛋白提取、还原烷基化、酶切、肽段净化、定量策略选择、LC-MS/MS 采集和数据质量评估。
适用范围与实验要求
- 样本：培养细胞与组织
- 样本：血清、血浆和其他体液
- 样本：微生物与植物样本
- 样本：免疫富集物或纯化蛋白
- 物种：人、小鼠、大鼠、微生物、植物及其他具有蛋白数据库的物种
- 难度与耗时：高级，约 5–14 天；深度分析另计
- 安全：样本按来源执行生物安全要求；有机溶剂、酸和烷基化试剂在合适条件下操作；质谱样本避免角蛋白、聚合物和交叉样本污染。
实验原理
复杂蛋白样本经标准化提取和酶切转化为肽段，通过液相色谱分离并进入串联质谱检测；采用标签、无标记或数据非依赖采集策略，对肽段和蛋白进行鉴定、相对或绝对定量。
标准工作流程
- 确定研究设计、定量策略、批次和随机化方案
- 低温提取蛋白并去除不兼容杂质
- 定量并统一蛋白投入量
- 完成还原、烷基化和受控酶切
- 净化、脱盐并按需要标记、分级或富集肽段
- 按系统适配浓度进样并穿插空白与 QC
- 完成 LC-MS/MS 采集和原始文件完整性检查
- 执行数据库检索、错误发现率控制、定量归一化和统计解释
设备、试剂与耗材
- 设备：冷冻离心与蛋白定量设备、恒温振荡和真空浓缩设备、纳升级液相色谱-串联质谱系统、肽段与数据质量分析工作站
- 试剂：兼容质谱的蛋白裂解与抑制体系、还原、烷基化和蛋白酶切试剂、肽段脱盐、分级或富集材料、内标、保留时间标准和定量标记试剂
- 耗材：低蛋白吸附管与滤芯枪头、超滤或净化耗材、脱盐柱、色谱柱和样品瓶、低背景手套及洁净操作耗材
必需对照与 QC
- 流程空白
- 标准蛋白或标准肽混合物
- 批次 QC 混合样本
- 内标或保留时间标准
- 生物学重复与技术重复
- 蛋白回收与酶切效率满足标准；空白污染低；内标和 QC 样本保留时间、质量误差及信号稳定；肽段和蛋白鉴定通过预设错误发现率；批次漂移和重复变异受控。
关键参数与结果解释
样本均一性、裂解体系、蛋白投入、酶切效率、污染物、色谱稳定性、质谱质量精度、动态排除或 DIA 窗口、批次顺序和缺失值处理影响结果可靠性。
蛋白丰度变化应结合肽段一致性、缺失机制、批次效应、多重检验和效应量解释。发现性结果宜通过靶向质谱、免疫学或功能实验验证。
常见问题与排错
鉴定数低时检查提取、酶切、脱盐和进样量；角蛋白污染高时加强洁净操作；色谱峰形差时排查柱效、溶剂和样本盐分；QC 漂移时维护系统并重新评估批次；缺失值高时优化采集策略和样本复杂度。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。