从组织或细胞样本制备高活率单细胞悬液，完成细胞计数、微液滴或孔板分隔、条形码标记、文库构建和上机前质量控制。
实验目的
从组织或细胞样本制备高活率单细胞悬液，完成细胞计数、微液滴或孔板分隔、条形码标记、文库构建和上机前质量控制。
适用范围与实验要求
- 样本：新鲜组织消化细胞
- 样本：培养细胞与原代细胞
- 样本：外周血或免疫细胞
- 样本：经验证的冻存细胞或细胞核
- 物种：人、小鼠、大鼠、其他具有高质量参考注释的物种
- 难度与耗时：高级，约 2–4 天；测序与生信分析另计
- 安全：样本采集与处理需具备相应审批；尽量缩短离体时间；扩增前后分区并执行 RNase、气溶胶和交叉样本控制。
实验原理
将单个细胞与带细胞条形码和 UMI 的捕获体系隔离，使每个细胞的转录本在逆转录与扩增后可被追溯，测序后通过质控、降维、聚类和标志基因分析解析细胞异质性。
标准工作流程
- 制定样本获取、运输和批次平衡方案
- 温和解离并去除碎片和细胞团
- 评估活率、浓度和细胞大小分布
- 按目标回收量计算上样并完成单细胞分隔
- 逆转录、条形码标记和 cDNA 扩增
- 构建基因表达文库并纯化
- 完成浓度、片段分布和污染 QC
- 测序后执行细胞过滤、双细胞识别、归一化、聚类与注释
设备、试剂与耗材
- 设备：生物安全柜与低温离心机、自动或手动细胞计数设备、单细胞分隔平台、PCR 仪与文库 QC 设备
- 试剂：组织解离与细胞保存试剂、死细胞去除或细胞富集试剂、单细胞捕获与条形码体系、逆转录与文库扩增试剂、磁珠纯化和定量试剂
- 耗材：低吸附无 RNase 管、细胞过滤器、芯片、微流控耗材或孔板、PCR 管板与滤芯枪头
必需对照与 QC
- 细胞活率与浓度复核
- 空白或无细胞通道
- 已知细胞混合样本
- 批次间参考样本
- 文库阴性对照
- 活率与浓度满足平台要求；细胞团和碎片受控；文库浓度及片段分布合格；有效细胞数、每细胞基因数、UMI、线粒体比例和双细胞率达到项目标准。
关键参数与结果解释
离体时间、解离强度、活率、细胞浓度、双细胞率、环境 RNA、目标回收量、扩增循环、测序深度和批次平衡决定数据质量。
聚类和细胞类型注释依赖质量过滤、批次校正和参考标志。低质量细胞、应激响应、环境 RNA 与双细胞可能形成伪亚群，关键发现需通过流式、成像或空间方法验证。
常见问题与排错
活率低时缩短处理并优化解离；细胞团多时增加过滤和温和吹打；环境 RNA 高时减少裂解细胞并优化清洗；回收量偏差时重新核对计数、浓度和平台装载参数。
产品 BOM 入口
科研用途说明：本流程仅用于科研实验设计和产品选型；具体参数、兼容性、规格、价格和交付以项目评估及正式报价为准。